北京化工大学 870《生物化学综合》考研复习资料 · 第五册
- 2026-11-05 05:14:06
北京化工大学 870《生物化学综合》考研复习资料 · 第五册
DNA 复制、RNA 转录、蛋白质翻译与基因表达调控
开篇：这一册是拉分的地方
前四册是"物质与能量"，这一册是"信息"。870 的命题在 2020 年之后明显向分子部分倾斜：判断和选择里分子部分占 14 分左右，论述题 5 道里通常有 2 道出自这里（一道技术方法、一道前沿文献）。
原因不难理解。北化的生命学院和材料学院都在做生物工程、合成生物学、生物医药，命题人本身就在这个领域，出题自然偏向自己的研究视野。所以这一册不能只背"中心法则"四个字，要能说清楚"复制和转录有什么不同""为什么原核和真核的翻译起始不一样""CRISPR 的原理是什么"。
这一册的结构是严格按中心法则走的：
DNA 复制（信息代代相传）→ RNA 转录（信息从 DNA 到 RNA）→ 蛋白质翻译（信息从 RNA 到蛋白质）→ 基因表达调控（信息何时何地用）→ 基因工程（人如何改造信息）
前四步是"自然怎么做的"，最后一步是"人怎么做的"。870 的论述题偏爱最后一步。
第 10 章 DNA 的生物合成（复制）
本章知识骨架
DNA 复制
├── 半保留复制
│ ├── Watson-Crick 预测
│ └── Meselson-Stahl 密度梯度离心实验
├── 复制的起点、方向和方式
│ ├── 复制起点（oriC）、复制子、复制叉
│ ├── 双向复制、单向复制
│ └── 半不连续复制、冈崎片段
├── 参与复制的酶和蛋白 ★★★
│ ├── 解旋酶（DnaB）、SSB、拓扑异构酶/促旋酶
│ ├── 引物酶（DnaG，合成 RNA 引物）
│ ├── DNA 聚合酶（I、II、III、IV、V）
│ ├── DNA 连接酶
│ └── 真核的 pol α、β、γ、δ、ε
├── 原核复制过程
│ ├── 起始（oriC、DnaA、ATP）
│ ├── 延伸（前导链连续、滞后链不连续）
│ └── 终止（Ter 位点、Tus 蛋白）
├── 真核复制
│ ├── 多复制子、细胞周期调控（S 期）
│ ├── 端粒与端粒酶
│ └── 核小体的装配
├── 逆转录
├── DNA 的损伤与突变
│ ├── 突变类型（点突变、移码、缺失、插入）
│ └── 诱变因素
├── DNA 的修复 ★★★
│ ├── 直接修复（光复活、烷基转移）
│ ├── 切除修复（BER、NER）
│ ├── 错配修复（MMR）
│ ├── 重组修复
│ ├── 双链断裂修复（HR、NHEJ）
│ └── SOS 修复（易错修复）
└── 复制与转录的比较
10.1 半保留复制
10.1.1 概念的提出
Watson 和 Crick 在 1953 年提出双螺旋模型时，同时预测了复制的机制：两条链解开，各自作为模板合成互补链，子代 DNA 一条链来自亲代、一条链是新合成的。这叫半保留复制（semiconservative replication）。
当时还有两个竞争模型：
全保留复制：亲代双链完整保留，新合成一个完整的双链。 弥散复制：亲代 DNA 被切成片段，与新合成的片段随机拼接。
10.1.2 Meselson-Stahl 实验（1958）
方法：大肠杆菌在含 ¹⁵N（重氮）的培养基中培养多代，DNA 全部被 ¹⁵N 标记（重 DNA，密度 1.724 g/mL）。然后转到 ¹⁴N（轻氮）培养基中，每隔一代取样，用 CsCl 密度梯度离心分析 DNA 的密度。
结果：
第 0 代：一条重带（¹⁵N/¹⁵N）。 第 1 代：一条中带（¹⁵N/¹⁴N），密度居中。 第 2 代：一条中带 + 一条轻带（¹⁴N/¹⁴N），比例 1:1。 第 3 代：中带 + 轻带，轻带比例增加。
结论：第一代全是杂合 DNA，说明亲代双链被"半保留"地分配到两个子代分子中。这排除了全保留（第一代应有一条重带一条轻带）和弥散复制（第一代应是弥散的中带，且后续不会出现清晰的轻带）。
这个实验的意义：它是分子生物学史上最优雅的实验之一，用物理方法（密度）解决了生物学问题。后来 Taylor 用 ³H-胸苷放射自显影在真核细胞（蚕豆根尖）中证实了半保留复制。
10.2 复制的起点、方向与方式
10.2.1 复制起点与复制子
复制起点（origin of replication, ori）：DNA 复制起始的特定序列。
大肠杆菌 oriC：245 bp，含 4 个 9 bp 的 DnaA 结合位点（DnaA box，序列 TTATCCACA）和 3 个 13 bp 的富含 AT 的重复序列（帮助解链）。 真核：多个复制起点（酵母的 ARS，含 ACS 序列），人类基因组有数万个起点，每个起点负责 50—300 kb。
复制子（replicon）：一个复制起点控制的复制单位。原核生物通常只有一个复制子（环状染色体），真核生物有多个复制子。
复制叉（replication fork）：复制时 DNA 双链解开形成的 Y 形结构。复制叉移动的方向就是复制的方向。
10.2.2 双向复制
大多数生物的复制是双向的：从起点向两个相反方向各形成一个复制叉，同时推进。用放射自显影可以看到"眼"形结构（复制泡），中间是起点，两端是复制叉。
单向复制的例子：某些质粒（如 pT181）、线粒体 DNA 的 D 环复制（一条链先复制，另一条链后复制）。
10.2.3 半不连续复制与冈崎片段
问题：DNA 聚合酶只能沿 5'→3' 方向合成，而两条模板链方向相反。怎么同时复制？
答案：一条链连续合成，另一条链分段合成。
前导链（leading strand）：模板链是 3'→5' 方向（相对复制叉移动方向），新链可以沿 5'→3' 连续合成，与复制叉同向。 滞后链（lagging strand）：模板链是 5'→3' 方向，新链必须分段合成，每段都从 5'→3' 方向（背离复制叉），形成一系列短片段，称为冈崎片段（Okazaki fragments）。
冈崎片段的长度：原核约 1000—2000 nt，真核约 100—200 nt（因为核小体的间隔）。
发现：冈崎令治夫妇于 1968 年在大肠杆菌中发现，用短脉冲 ³H-胸苷标记，先出现短片段，后连接成长链。
意义：半不连续复制解决了"两条反向平行链如何同时复制"的矛盾，是 DNA 复制机制的核心。
10.3 参与复制的酶和蛋白
这是本章最重要的表，几乎每年都考。
10.3.1 原核 DNA 聚合酶（大肠杆菌）
pol III 的特点
全酶由 20 多个亚基组成：核心酶（α、ε、θ）、滑动钳（β 二聚体）、钳 loader（γ 复合体）、τ 亚基等。 α 亚基：聚合活性。 ε 亚基：3'→5' 外切酶活性，负责校对（错配率从 10⁻⁵ 降到 10⁻⁷）。 β 滑动钳：环状，套在 DNA 上，使酶不脱落，提高持续性（processivity，可达 10⁵ nt 以上）。 一个全酶同时合成前导链和滞后链（二聚体模型），滞后链的模板形成"环"，使两端的合成方向一致。
pol I 的特点
单条多肽链，三个活性在一个蛋白上：5'→3' 聚合、3'→5' 外切、5'→3' 外切。 5'→3' 外切活性用于切除 RNA 引物（切口平移）。 Klenow 片段：pol I 被胰蛋白酶切割后的大片段，保留聚合和 3'→5' 外切活性，用于分子生物学实验（填补、标记）。 不是主要的复制酶，但在引物去除和修复中必需。
pol I 与 pol III 的分工：pol III 延伸，pol I 切引物并填补，连接酶封口。这是"流水线"式的分工。
10.3.2 真核 DNA 聚合酶
真核与原核的差异：
真核的聚合酶分工更细（前导链和滞后链用不同的酶）。 真核复制受细胞周期严格调控，只在 S 期进行。 真核需要解决核小体的问题（复制叉前进时核小体解聚，新链合成后重新装配）。 真核有多个复制子，同时启动，速度快但每个复制子较短。
10.4 原核生物的复制过程
10.4.1 起始
DnaA 结合 oriC：多个 DnaA 蛋白（需 ATP）结合到 oriC 的 DnaA box 上，形成复合物。 解链：DnaA 使富含 AT 的 13 bp 重复序列解链（AT 只有 2 个氢键，易解），形成开放的复合物。 装载解旋酶：DnaC 帮助 DnaB 装载到单链上，DnaB 沿 5'→3' 方向移动，扩大解链区。 SSB 结合：稳定单链。 引物合成：引物酶（DnaG）在单链上合成 RNA 引物。 pol III 装载：开始延伸。
调控：oriC 的甲基化状态（Dam 甲基化酶）、DnaA 的 ATP/ADP 比例、SeqA 蛋白的隔离作用，共同保证每个细胞周期只起始一次。
10.4.2 延伸
前导链：一个引物，pol III 连续延伸。 滞后链：每个冈崎片段需要一个新引物，pol III 合成片段后，pol I 切除引物并填补，连接酶封口。 拓扑问题：复制叉前进产生正超螺旋，促旋酶不断消除。
速度：大肠杆菌约 1000 nt/s，双向复制，整个基因组（4.6 Mb）约 40 分钟复制完成。
10.4.3 终止
复制叉到达 Ter 位点（含 5 个 Ter 序列），Tus 蛋白结合 Ter，形成"单向闸门"，阻止复制叉继续前进。 两个复制叉在 Ter 区相遇，复制终止。 子代 DNA 是连环体（catenane），需要拓扑异构酶 IV 分离。
注意：环状 DNA 复制没有"末端问题"，因为它是闭合的，引物去除后由连接酶封口即可。这个对比在讲端粒时要用。
10.5 真核生物的复制
10.5.1 细胞周期调控
G1 期：准备，决定是否进入 S 期（限制点）。 S 期：DNA 复制。每个复制起点只启动一次（licensing 机制：MCM 复合体在 G1 装载，S 期被激活后解离，防止再启动）。 G2 期：检查复制是否完成、有无损伤。 M 期：有丝分裂。
关键调控：CDK（周期蛋白依赖性激酶）-cyclin 复合体。S 期的 CDK 活性磷酸化复制起始蛋白，启动复制；同时抑制 MCM 的重新装载。
10.5.2 端粒与端粒酶
末端复制问题（end replication problem）
线性 DNA 复制时，滞后链的最后一个冈崎片段去除 RNA 引物后，末端会留下一个缺口（因为 DNA 聚合酶不能从 3' 端向 5' 方向填补，也不能在末端起始新链）。每复制一次，染色体缩短约 50—200 bp。这就是"末端复制问题"。
端粒（telomere）
真核染色体末端的重复序列：人类是 TTAGGG，重复 1000—2000 次（5—15 kb）。 功能：保护末端不被核酸酶降解、防止末端被识别为双链断裂（避免端粒融合）、解决末端复制问题。
端粒酶（telomerase）
是一种核糖核蛋白，本质是逆转录酶。 组成：hTERT（催化亚基，逆转录酶活性）+ hTR（RNA 模板，序列 3'-CAAUCCCAAUC-5'，含与 TTAGGG 互补的序列）+ 辅助蛋白。 机制：hTR 的 RNA 与端粒的 3' 悬垂端配对，hTERT 以 RNA 为模板合成 TTAGGG 重复，延伸 3' 端；然后引物酶和 pol α 合成互补链，完成末端复制。 表达：在干细胞、生殖细胞、活化淋巴细胞、85%—90% 的癌细胞中高表达；在多数体细胞中低表达或不表达。
端粒与衰老：体细胞端粒随分裂次数缩短，缩短到临界长度（Hayflick 界限）时触发复制性衰老。这是"端粒衰老学说"的核心。
端粒酶与癌症：癌细胞通过激活端粒酶（或 ALT 途径）维持端粒长度，获得无限增殖能力。端粒酶抑制剂（如 imetelstat）是抗癌药物研发方向。
端粒酶与疾病：
端粒酶缺陷 → 先天性角化不良（皮肤色素异常、指甲营养不良、口腔白斑、骨髓衰竭）。 端粒酶过度激活 → 癌症。
10.5.3 核小体的装配
复制叉前进时，亲代核小体解聚为 H3/H4 四聚体和 H2A/H2B 二聚体，随机分配到两个子代 DNA 上；新合成的组蛋白（在 S 期大量表达）与 CAF-1（染色质装配因子 1）一起装配到新链上，形成核小体。组蛋白的修饰（甲基化、乙酰化）部分被继承，这是"表观遗传"的物质基础之一。
10.6 逆转录
定义：以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，由逆转录酶（reverse transcriptase） 催化。
发现：1970 年 Temin 和 Baltimore 分别在劳氏肉瘤病毒和小鼠白血病病毒中发现，推翻"中心法则单向流动"的观念，中心法则被修正为"DNA ⇄ RNA → 蛋白质"。
逆转录酶的三项活性
RNA 依赖的 DNA 聚合酶：以 RNA 为模板合成 cDNA。 RNase H：水解 RNA-DNA 杂交体中的 RNA。 DNA 依赖的 DNA 聚合酶：以第一条 DNA 链为模板合成第二条 DNA 链。
逆转录病毒的生活周期
病毒 RNA 基因组进入细胞。 逆转录酶以 RNA 为模板合成负链 DNA，形成 RNA-DNA 杂交体。 RNase H 降解 RNA。 以负链 DNA 为模板合成正链 DNA，形成双链 DNA（前病毒）。 前病毒整合到宿主基因组（由整合酶催化）。 转录、翻译、装配新病毒。
应用
cDNA 合成：从 mRNA 逆转录得到 cDNA，构建 cDNA 文库，用于基因克隆和表达。这是分子生物学的核心技术。 RT-PCR：检测 RNA（如病毒 RNA、mRNA 表达量）。新冠病毒核酸检测就是 RT-qPCR。 逆转录酶抑制剂：AZT、拉米夫定、替诺福韦，治疗 HIV。 端粒酶：本质是逆转录酶。 逆转座子：基因组中的逆转座元件（LINE、SINE、Alu 序列）通过逆转录机制移动，占人类基因组的 40% 以上。
10.7 DNA 的损伤与突变
10.7.1 损伤类型
10.7.2 突变类型
按大小分
点突变：单个碱基的改变。 转换（transition）：嘌呤换嘌呤（A↔G）、嘧啶换嘧啶（C↔T）。 颠换（transversion）：嘌呤换嘧啶或反之。 插入/缺失：导致移码突变（frameshift），改变下游所有密码子，后果通常严重。 动态突变：三核苷酸重复扩增（如亨廷顿病的 CAG 重复）。
按表型效应分
同义突变（沉默突变）：密码子改变但氨基酸不变（第三位摆动）。 错义突变：氨基酸改变。可能无害，也可能致病（如 HbS）。 无义突变：密码子变为终止密码子，产生截短的蛋白。 移码突变：读框改变，下游全部改变。
按来源分
自发突变：复制错误（10⁻⁹/碱基/代）、碱基的互变异构、脱氨、氧化。 诱发突变：物理（UV、X 射线）、化学（烷化剂、碱基类似物、嵌入剂如溴化乙锭）、生物（转座子、病毒）。
** Ames 试验**：用鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸缺陷株检测化学物的致突变性，是致癌物筛选的标准方法。
10.8 DNA 的修复
10.8.1 直接修复
光复活（photoreactivation）：光复活酶（DNA 光解酶）吸收可见光能量，直接断裂嘧啶二聚体的环丁烷环。存在于细菌、植物、部分动物，人类没有（人类靠核苷酸切除修复）。 烷基转移：O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶把甲基转移到自身的 Cys 上，修复烷化损伤。这个酶是"自杀性"的（一次使用后失活）。 单链断裂的直接连接：DNA 连接酶。
10.8.2 切除修复
碱基切除修复（BER）
DNA 糖苷酶识别并切除受损碱基，形成 AP 位点。 AP 核酸内切酶切开 AP 位点的磷酸二酯键。 DNA 聚合酶 β（真核）填补缺口。 DNA 连接酶封口。
适用：单个碱基的损伤（氧化、脱氨、烷化）。
核苷酸切除修复（NER）
识别损伤（由 XPC、XPA、XPE 等蛋白），在损伤两侧解链。 TFIIH（含 XPB、XPD 解旋酶）在损伤两侧切开（约 24—32 nt 的片段）。 切除含损伤的寡核苷酸。 DNA 聚合酶 δ/ε 填补。 连接酶封口。
适用：大的加合物，尤其是嘧啶二聚体。
NER 缺陷病
着色性干皮病（XP）：NER 基因（XPA—XPG）突变，紫外线损伤不能修复，皮肤对光极度敏感，早发皮肤癌。 柯凯因综合征（Cockayne 综合征）：转录偶联的 NER 缺陷，生长迟缓、神经系统退化。
10.8.3 错配修复（MMR）
MutS（真核 MSH2/MSH6）识别错配。 MutL（真核 MLH1/PMS2）被招募，决定哪条链是新合成的（通过甲基化标记或缺口识别）。 切除含错配的新链片段。 聚合酶填补，连接酶封口。
MMR 缺陷：遗传性非息肉性结直肠癌（HNPCC，Lynch 综合征），微卫星不稳定（MSI）是其标志。这是因为 MMR 缺陷导致重复序列长度不稳定。
10.8.4 重组修复
双链断裂（DSB）的修复
同源重组修复（HR）：以姐妹染色单体为模板，精确修复。涉及 RAD51、BRCA1/2。发生在 S/G2 期。 非同源末端连接（NHEJ）：直接把断裂端连接，不需要模板，但容易出错（产生小缺失或插入）。涉及 KU70/80、DNA-PK、Ligase IV。发生在整个细胞周期，是哺乳动物 DSB 的主要修复方式。
BRCA1/2 突变：HR 缺陷，DSB 不能精确修复，基因组不稳定，乳腺癌和卵巢癌风险大幅升高。PARP 抑制剂（奥拉帕尼）利用"合成致死"原理：BRCA 缺陷的细胞已经不能做 HR，再用 PARP 抑制剂阻断 BER，细胞就完全无法修复 DNA，从而死亡。这是精准医学的经典案例。
10.8.5 SOS 修复
细菌在严重 DNA 损伤时启动的应急反应。RecA 蛋白被单链 DNA 激活，促使 LexA 阻遏蛋白自我切割，解除对 SOS 基因的抑制，表达 pol IV、pol V 等易错聚合酶，进行跨损伤合成（translesion synthesis）。
特点：能救活细胞，但容易出错，引入突变。这是"以突变换生存"的策略。
RecA 的功能：除了激活 SOS，还参与同源重组（相当于真核的 RAD51）。
10.8.6 修复缺陷与疾病
10.9 复制与转录的比较
这个表是简答题的固定素材。
记忆要点：复制"全、双、需引物、有校对"；转录"单、不连续但无片段、不需引物、无校对"。
10.10 本章高频考点与易错点
判断题陷阱
"DNA 复制是全保留的"——错，半保留。 "DNA 聚合酶能从头起始新链"——错，需要引物；RNA 聚合酶不需要引物。 "DNA 聚合酶 III 有 5'→3' 外切活性"——错，pol I 才有。 "DNA 聚合酶 I 是主要的复制酶"——错，pol III 是。 "冈崎片段出现在前导链上"——错，在滞后链上。 "真核生物的冈崎片段比原核长"——错，更短（100—200 vs 1000—2000）。 "端粒酶是 DNA 聚合酶"——错，是逆转录酶。 "端粒酶在所有体细胞中都高表达"——错，多数体细胞低表达，癌细胞高表达。 "环状 DNA 复制也有末端缩短问题"——错，环状没有末端。 "光复活修复在人类中存在"——错，人类没有光复活酶。 "SOS 修复是精确修复"——错，是易错修复。 "错配修复缺陷导致着色性干皮病"——错，导致 HNPCC；XP 是 NER 缺陷。 "同源重组修复容易出错"——错，NHEJ 才容易出错。 "DNA 连接酶连接时需要 ATP"——正确（真核和多数原核），部分细菌用 NAD⁺。 "逆转录酶只存在于逆转录病毒中"——错，端粒酶、逆转座子也有关。
简答题高频
Meselson-Stahl 实验的原理和结论。 半不连续复制的机制及意义。 参与复制的酶和蛋白及其功能。 原核 DNA 聚合酶 I 和 III 的比较。 端粒和端粒酶的结构、功能及与衰老和癌症的关系。 DNA 损伤的类型及修复途径。 复制与转录的比较。 逆转录的过程及应用。 真核与原核复制的差异。 为什么 DNA 复制需要 RNA 引物？
论述题方向
从 DNA 双螺旋到复制，说明遗传信息精确传递的分子机制。 DNA 损伤修复与肿瘤发生、肿瘤治疗的关系。 端粒、端粒酶与细胞衰老、永生化。 基因组的稳定性如何维持？复制、修复、重组三个层面。 逆转录与中心法则的修正。
第 11 章 RNA 的生物合成（转录）
本章知识骨架
转录
├── 基本概念
│ ├── 模板链（反义链）、编码链（sense strand）
│ ├── 不对称转录
│ └── 转录单位
├── 原核 RNA 聚合酶
│ ├── 核心酶（α₂ββ'ω）+ σ 因子 = 全酶
│ ├── σ 因子识别启动子
│ └── 抑制剂（利福平）
├── 原核启动子
│ ├── -10 区（TATAAT，Pribnow box）
│ ├── -35 区（TTGACA）
│ └── 共有序列与启动子强度
├── 转录过程
│ ├── 起始（闭合复合物 → 开放复合物 → 三元起始复合物）
│ ├── 延伸（σ 因子脱落、转录泡）
│ └── 终止（不依赖 ρ：发夹 + polyU；依赖 ρ：ρ 因子的解旋酶活性）
├── 真核 RNA 聚合酶
│ ├── pol I（rRNA）、pol II（mRNA）、pol III（tRNA、5S rRNA）
│ ├── 启动子（TATA box、CAAT box、GC box）
│ ├── 转录因子（TFIID/TBP、TFIIB、TFIIH）
│ └── 抑制剂（α-鹅膏蕈碱）
├── 真核 mRNA 的加工
│ ├── 加帽（m⁷G）
│ ├── 加尾（poly A）
│ ├── 剪接（剪接体、snRNP）
│ ├── 可变剪接
│ └── RNA 编辑
├── rRNA 和 tRNA 的加工
└── 转录的抑制剂
11.1 转录的基本概念
转录（transcription）：以 DNA 为模板、由 RNA 聚合酶催化、合成 RNA 的过程。
模板链（template strand）：被转录的那条 DNA 链，方向是 3'→5'（因为 RNA 沿 5'→3' 合成）。
编码链（coding strand，又称 sense strand）：与模板链互补的那条链，序列与 RNA 相同（只是 T 换成 U）。文献中给出的基因序列通常写编码链。
不对称转录：在一个转录单位中，只有一条链被转录。同一个染色体上不同的基因可能用不同的链作模板。
转录单位：从启动子到终止子的 DNA 区段，编码一个 RNA 分子。原核的一个转录单位可以包含多个基因（多顺反子）。
11.2 原核生物的 RNA 聚合酶
组成：核心酶（α₂ββ'ω）+ σ 因子 = 全酶。
σ 因子的作用
全酶（含 σ）能特异结合启动子；核心酶（无 σ）只能非特异结合 DNA。 σ 因子降低 RNA 聚合酶对非特异 DNA 的亲和力，提高对启动子的亲和力。 起始完成后 σ 因子脱落，核心酶继续延伸。
σ 因子的种类：大肠杆菌有多种 σ 因子，识别不同的启动子，应对不同的环境：
σ⁷⁰（σ^D）：管家基因，识别标准启动子。 σ³²（σ^H）：热休克基因。 σ²⁸（σ^F）：鞭毛基因。 σ⁵⁴（σ^N）：氮代谢基因。
这种"σ 因子切换"是原核基因表达调控的一种方式（全基因组层面的调控）。
抑制剂
利福平（rifampicin）：结合 β 亚基，抑制转录起始（不抑制延伸）。是抗结核药。 利迪链菌素：结合 β 亚基，抑制起始。 放线菌素 D：嵌入 DNA，抑制转录延伸（对原核和真核都有效）。
11.3 原核启动子
启动子（promoter）：RNA 聚合酶识别、结合并起始转录的 DNA 序列，位于转录起始位点上游。
三个保守区
共有序列（consensus sequence）：把多个启动子比对后每个位置出现频率最高的碱基。共有序列越接近，启动子越强。
启动子强度：-35 和 -10 区与共有序列的相似程度决定转录起始的频率。强启动子（如 rRNA 基因的启动子）可以每秒起始多次，弱启动子（如 lac 的启动子）频率低。
UP 元件：部分强启动子在 -40 到 -60 区有 UP 元件，被 α 亚基的 C 端识别，增强转录。
11.4 原核转录的过程
11.4.1 起始
闭合复合物：全酶（含 σ⁷⁰）非特异结合 DNA，沿 DNA 滑动，找到启动子，形成闭合复合物（DNA 双链未打开）。 开放复合物：-10 区富含 AT，容易解链，RNA 聚合酶使 -10 到 +2 区约 12—14 bp 解链，形成转录泡。 三元起始复合物：第一个 NTP（通常是 ATP 或 GTP）结合到起始位点（+1），与第二个 NTP 形成第一个磷酸二酯键。 σ 因子脱落：转录起始后，σ 因子释放，核心酶进入延伸阶段。
"流产式起始"（abortive initiation）：起始阶段常常合成 2—9 nt 的短片段后脱落，反复尝试，直到成功进入延伸。这是转录起始的一个特点。
11.4.2 延伸
核心酶沿模板链 3'→5' 方向移动，RNA 沿 5'→3' 方向延伸。 转录泡约 17 bp，RNA-DNA 杂交区约 8 bp。 后面 DNA 复性，前面 DNA 解链。 拓扑问题：转录泡前方的正超螺旋由促旋酶消除，后方的负超螺旋由拓扑异构酶 I 消除。 速度：约 40—50 nt/s（比复制慢得多）。
11.4.3 终止
不依赖 ρ 因子的终止（内在终止）
终止子序列含一段富含 GC 的反向重复序列 + 一段富含 AT 的序列。 转录出的 RNA 形成发夹结构（茎环），随后是一串 polyU（约 6—8 个 U）。 机制：发夹结构使 RNA 聚合酶停顿；polyU 与模板的 polyA 之间只有 2 个氢键（rU-dA 配对弱），RNA-DNA 杂交体不稳定，RNA 脱落，转录终止。
依赖 ρ 因子的终止
ρ 因子：六聚体蛋白，有 RNA 依赖的 ATP 酶活性和解旋酶活性。 机制：ρ 结合到新生 RNA 的 5' 端（识别 rut 位点，富含 C 的序列），沿 RNA 向 3' 方向移动（消耗 ATP）；追上 RNA 聚合酶后，利用解旋酶活性把 RNA 从 RNA-DNA 杂交体中拉出，终止转录。 特点：需要 ATP，终止位点没有明显的序列特征。
终止的调控意义：终止效率可以调节，形成"衰减"（attenuation）机制（第 13 章讲）。
11.5 真核生物的 RNA 聚合酶
线粒体 RNA 聚合酶：由核基因编码，类似噬菌体的单亚基酶，对 α-鹅膏蕈碱不敏感。
α-鹅膏蕈碱（α-amanitin）：来自毒鹅膏菌（death cap）的环肽，是转录研究的重要工具，也是毒蘑菇致死的原因（抑制 pol II，肝细胞不能合成 mRNA，肝功能衰竭）。
真核启动子
转录因子
通用转录因子（GTF）：TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH，与 pol II 一起形成起始复合物。 TFIID = TBP + TAFs，识别 TATA box。 TFIIH：有解旋酶活性和激酶活性（磷酸化 pol II 的 CTD），参与启动子解链和转录起始。 特异转录因子：识别增强子/沉默子，调控特定基因（如 p53、NF-κB、雌激素受体）。 中介体（Mediator）：连接转录因子和 pol II，整合信号。
pol II 的 CTD（羧基端结构域）：含 7 个氨基酸的重复序列（YSPTSPS），重复 52 次。CTD 的磷酸化状态决定转录的阶段：低磷酸化时参与起始，Ser5 磷酸化时参与加帽，Ser2 磷酸化时参与延伸和加尾。这是"转录与加工偶联"的分子基础。
11.6 真核 mRNA 的加工
11.6.1 加帽
结构：m⁷GpppN（7-甲基鸟苷通过 5'-5' 三磷酸键连接到第一个核苷酸）。
过程：RNA 三磷酸酶去掉 γ-磷酸 → 鸟苷酸转移酶加上 GMP → 甲基转移酶在 G 的 N7 位加甲基（SAM 供甲基）→ 必要时在第一个核苷酸的 2'-O 位加甲基。
功能：
保护 5' 端不被核酸酶降解。 帮助 mRNA 出核。 被帽结合蛋白（CBP/eIF4E） 识别，参与翻译起始。 参与剪接（靠近 5' 剪接位点的帽子复合物）。
11.6.2 加尾
信号：3' 端上游 10—30 nt 处的 AAUAAA（多聚腺苷酸化信号）。
过程：切割因子（CPSF、CstF）识别 AAUAAA 并在其下游切割；多聚腺苷酸聚合酶（PAP） 加上 80—250 个 A（不需要模板）；多聚腺苷酸结合蛋白（PABP）结合 poly(A)，保护尾巴。
功能：
增加稳定性（防止 3'→5' 外切酶降解）。 帮助出核。 参与翻译起始（PABP 与 eIF4G 相互作用，形成"闭环"模型）。 尾巴长度影响 mRNA 的寿命（去腺苷酸化是 mRNA 降解的第一步）。
11.6.3 剪接
定义：去除内含子、连接外显子的过程。
剪接位点
5' 剪接位点（供体位点）：GU（外显子-内含子边界）。 3' 剪接位点（受体位点）：AG（内含子-外显子边界）。 分支点（branch point）：内含子内，含一个 A（酵母的序列是 UACUAAC，哺乳动物较松散）。
剪接体（spliceosome）
由 5 种 snRNP（U1、U2、U4、U5、U6）和 200 多种蛋白组成，是动态组装的复合物。
剪接的两步转酯反应
第一步：分支点 A 的 2'-OH 攻击 5' 剪接位点，切断外显子 1 与内含子的连接，内含子的 5' 端与 A 形成 2'-5' 磷酸二酯键，形成**套索（lariat）**结构。 第二步：外显子 1 的 3'-OH 攻击 3' 剪接位点，两个外显子连接，内含子以套索形式释放，随后被降解。
剪接体的组装
U1 结合 5' 剪接位点。 U2 结合分支点（需 ATP）。 U4/U6-U5 三聚体加入。 U1 和 U4 释放，U6 与 5' 剪接位点结合，U2-U6 形成催化核心。 催化完成后剪接体解聚，snRNP 循环使用。
剪接的保真性：依赖剪接位点的保守序列、剪接体的校对、外显子连接复合物（EJC）的标记。
可变剪接
同一个 pre-mRNA 通过不同的剪接方式产生多种成熟 mRNA。类型包括：
外显子跳跃。 内含子保留。 可变 5'/3' 剪接位点。 互斥外显子。
调控：剪接增强子（ESE、ISE）和沉默子（ESS、ISS），由 SR 蛋白（促进）和 hnRNP（抑制）识别。
意义：人类约 95% 的多外显子基因存在可变剪接，是蛋白质多样性的主要来源。一个基因可以产生几十甚至上千种异构体（如果蝇的 Dscam 基因可产生 38016 种）。
剪接异常与疾病
β-地中海贫血：β-珠蛋白基因的剪接位点突变，导致异常剪接。 脊髓性肌萎缩症（SMA）：SMN1 基因缺失，SMN2 基因的剪接异常（外显子 7 跳跃），SMN 蛋白不足。治疗药物诺西那生是反义寡核苷酸，促进外显子 7 的包含。 强直性肌营养不良：CTG 重复扩增，导致剪接因子（MBNL）功能异常，多个基因的剪接错误。
11.6.4 RNA 编辑
定义：转录后改变 RNA 序列的过程。
类型：
碱基替换：C→U（ApoB，胞苷脱氨酶 APOBEC1）、A→I（谷氨酸受体，ADAR，I 被读作 G）。 插入/删除：锥虫线粒体的 RNA 编辑（向导 RNA 指导的 U 插入/删除）。
意义：扩展了基因组的编码能力；编辑异常与疾病相关（如 ADAR 功能异常与自身免疫、神经疾病）。
11.6.5 rRNA 和 tRNA 的加工
rRNA 的加工
真核：45S pre-rRNA（由 pol I 转录）→ 18S、5.8S、28S（经切割和修饰）。5S rRNA 由 pol III 单独转录。 修饰：甲基化（2'-O-甲基化）和假尿嘧啶化，由 snoRNA 指导（snoRNA 与蛋白形成 snoRNP，通过互补配对定位到 rRNA 的特定位置）。 原核：30S pre-rRNA → 16S、23S、5S，同样有甲基化和假尿嘧啶化。
tRNA 的加工
切除 5' 端的前导序列（RNase P，本身是核酶）。 切除 3' 端的多余序列，加上 CCA（tRNA 核苷酸转移酶）。 剪接去除内含子（tRNA 剪接酶 + 连接酶，机制与 mRNA 剪接不同）。 碱基修饰：甲基化、假尿嘧啶化、脱氨（A→I）、硫代等，形成稀有碱基。
11.7 转录的抑制剂
注意区分：放线菌素 D 作用于 DNA 模板，不是酶；利福平作用于细菌的酶，对真核无效（所以是抗生素）；α-鹅膏蕈碱作用于真核的酶。
11.8 本章高频考点与易错点
判断题陷阱
"转录的模板链就是编码链"——错，模板链与编码链互补，编码链与 RNA 相同。 "RNA 聚合酶需要引物"——错，不需要。 "原核 RNA 聚合酶的核心酶能特异识别启动子"——错，需要 σ 因子。 "σ 因子在延伸阶段仍结合在酶上"——错，起始后脱落。 "利福平抑制转录延伸"——错，抑制起始。 "α-鹅膏蕈碱抑制 pol I"——错，抑制 pol II（低浓度），pol I 不敏感。 "真核 mRNA 是 5' 加 poly(A)、3' 加帽子"——错，反了。 "内含子的剪接位点是 GU-AG"——正确（多数）。 "剪接过程消耗 ATP"——正确（剪接体组装和重排需要 ATP）。 "可变剪接增加蛋白质多样性"——正确。 "poly(A) 尾巴是由 DNA 模板编码的"——错，无模板添加。 "原核 mRNA 有帽子和尾巴"——错，没有。 "转录和翻译在原核中可以同时进行"——正确（转录翻译偶联）。 "真核转录和翻译都在细胞核"——错，转录在核，翻译在胞质。 "增强子的作用与位置和方向有关"——错，无关。
简答题高频
复制与转录的比较。 原核 RNA 聚合酶的结构及各亚基功能。 原核启动子的结构及 σ 因子的作用。 转录终止的两种机制。 真核 RNA 聚合酶的种类及产物。 真核 mRNA 的加工过程。 剪接体的组成和剪接机制。 可变剪接的类型及意义。 RNA 编辑的概念及类型。 转录抑制剂的种类及作用位点。
论述题方向
从基因到蛋白质，说明遗传信息表达的全过程。 真核基因表达的多层次调控（本章 + 第 13 章）。 RNA 加工与疾病（剪接突变、RNA 编辑异常）。 非编码 RNA 的功能及研究进展。 转录调控与药物开发（以 α-鹅膏蕈碱、利福平、CDK 抑制剂为例）。
第 12 章 蛋白质的生物合成（翻译）
本章知识骨架
翻译
├── 遗传密码
│ ├── 密码子的基本特性（连续性、简并性、通用性、方向性、不重叠、摆动）
│ ├── 起始密码（AUG）、终止密码（UAA、UAG、UGA）
│ ├── 开放阅读框（ORF）
│ └── 密码子表与氨基酸的对应
├── 参与翻译的分子
│ ├── mRNA（模板）
│ ├── tRNA（搬运工，反密码子）
│ ├── 核糖体（工厂，A/P/E 位、肽基转移酶中心）
│ ├── 氨酰-tRNA 合成酶（活化，校对）
│ ├── 起始因子（IF/eIF）、延伸因子（EF/eEF）、释放因子（RF/eRF）
│ └── 能量（ATP、GTP）
├── 原核翻译
│ ├── 起始（SD 序列、fMet、IF1/2/3、30S）
│ ├── 延伸（进位、转肽、移位，EF-Tu/EF-G）
│ └── 终止（RF1/RF2/RF3）
├── 真核翻译
│ ├── 起始（帽子依赖、扫描模型、Kozak 序列、eIF4F）
│ ├── 延伸（eEF1、eEF2）
│ └── 终止（eRF）
├── 翻译后加工
│ ├── 切除（信号肽、前导序列）
│ ├── 修饰（磷酸化、糖基化、羟基化、乙酰化、泛素化）
│ ├── 折叠（分子伴侣）
│ └── 亚基组装、靶向运输
├── 蛋白质的靶向运输
│ ├── 信号肽假说、SRP、共翻译转运
│ ├── 线粒体、叶绿体（翻译后转运）
│ ├── 核定位信号（NLS）
│ └── 过氧化物酶体（PTS）
└── 翻译的抑制剂
12.1 遗传密码
12.1.1 密码子的基本特性
（1）连续性：mRNA 上的碱基从起始密码子开始，三个一组连续阅读，中间没有间隔、不重叠（除少数病毒的"重叠基因"）。
（2）简并性：大多数氨基酸有多个密码子。除 Met（AUG）和 Trp（UGG）各只有一个密码子外，其余 18 种氨基酸都有 2—6 个密码子。Leu、Ser、Arg 各有 6 个。
简并性的意义：① 减少突变的有害效应（第三位突变常为同义突变）；② 允许不同生物使用不同的密码子偏好（codon bias），优化翻译效率。
（3）通用性：从病毒到人类，几乎都用同一套密码子表。例外：线粒体（UGA 编码 Trp、AGA/AGG 编码终止、AUA 编码 Met）、某些原生动物（UAA/UAG 编码 Gln）、支原体（UGA 编码 Trp）。
通用性的意义：说明所有生物有共同的起源；也是基因工程中"人基因可以在细菌中表达"的基础。
（4）方向性：密码子的阅读方向是 5'→3'（mRNA），对应的多肽合成方向是 N→C。
（5）不重叠性：一般情况下，每个碱基只属于一个密码子。
（6）摆动性：见第 11 章 tRNA 部分。密码子第三位与反密码子第一位的配对可以有一定灵活性。
12.1.2 起始密码与终止密码
起始密码：AUG（编码 Met）。原核中也可用 GUG（Val）、UUG（Leu），但仍编码 fMet。
终止密码：UAA（ochre）、UAG（amber）、UGA（opal）。它们不编码氨基酸，被释放因子识别。
开放阅读框（ORF）：从起始密码子到终止密码子的一段连续序列，是一个潜在的蛋白质编码区。生物信息学中用来预测基因。
12.2 参与翻译的分子机器
12.2.1 核糖体
三个 tRNA 结合位点
A 位（aminoacyl site）：氨酰-tRNA 进入。 P 位（peptidyl site）：肽酰-tRNA 占据。 E 位（exit site）：空载 tRNA 离开。
肽基转移酶中心（PTC）：位于大亚基，催化肽键形成。催化活性由 23S/28S rRNA 承担，不是蛋白质——这是核酶的证据（2009 年诺贝尔化学奖）。
mRNA 通道：小亚基上，mRNA 从中穿过，一次暴露一个密码子。
tRNA 通道：大亚基上，新生肽链从通道挤出，避免被降解。
核糖体的其他功能位点：mRNA 结合位点、E 位、肽链出口、起始因子/延伸因子结合位点。
12.2.2 tRNA
三叶草二级结构，倒 L 三级结构。 3' 端 CCA，氨基酸酯化位点。 反密码子环，识别密码子。 稀有碱基增强稳定性和配对灵活性。
同工受体 tRNA（isoacceptor tRNA）：携带同一种氨基酸但反密码子不同的多种 tRNA。
12.2.3 氨酰-tRNA 合成酶
反应：氨基酸 + tRNA + ATP → 氨酰-tRNA + AMP + PPi
两步
氨基酸 + ATP → 氨酰-AMP + PPi（活化，形成混合酸酐）。 氨酰-AMP + tRNA → 氨酰-tRNA + AMP（把氨酰基转给 tRNA 的 3'-OH）。
校对机制（"双筛"）
合成位点的校对：错误的氨酰-AMP 会被水解（编辑活性）。 编辑位点的校对：错误的氨酰-tRNA 在独立的编辑结构域中被水解。
保真性的重要性：氨酰-tRNA 合成酶是"第二遗传密码"的解读器，它把氨基酸与 tRNA 正确配对。错误率约 10⁻⁴—10⁻⁵，加上核糖体的校对，总的翻译错误率约 10⁻³—10⁻⁴。
分类：两类（I 类和 II 类），结构不同，酰化位点不同（2'-OH 或 3'-OH），但最终都转移到 3'-OH 上（通过快速异构）。
12.3 原核生物的翻译
12.3.1 起始
参与因子：IF1、IF2（GTP 酶）、IF3。
步骤
30S 与 IF3 结合：IF3 阻止 30S 与 50S 提前结合。 mRNA 结合：30S 通过 16S rRNA 的 3' 端与 mRNA 的 SD 序列（Shine-Dalgarno 序列，AGGAGG） 互补配对，定位起始密码子 AUG。 起始 tRNA 结合：fMet-tRNA^fMet（甲酰甲硫氨酰-tRNA）与 IF2-GTP 结合，进入 P 位，反密码子与 AUG 配对。 50S 加入：IF3 释放，50S 结合，形成 70S 起始复合物，IF1、IF2 释放（GTP 水解）。
fMet 的特殊性
原核的起始氨基酸是 N-甲酰甲硫氨酸（fMet），由转甲酰基酶（10-甲酰-THF 供甲酰基）修饰 Met-tRNA 生成。 fMet 只用于起始，肽链内部的 Met 是正常的 Met。 原核有两种 tRNA^Met：tRNA^fMet（起始专用）和 tRNA^Met（内部使用）。
SD 序列的意义：它决定了翻译的起始位置，也决定了原核 mRNA 可以是多顺反子（每个顺反子有自己的 SD 序列）。
12.3.2 延伸
三步循环
进位（decoding）：氨酰-tRNA 与 EF-Tu-GTP 结合，进入 A 位。密码子与反密码子配对正确时，GTP 水解，EF-Tu 释放；错误配对时被排斥（动力学校对）。 转肽（peptidyl transfer）：P 位肽酰基的羰基碳被 A 位氨基酸的氨基攻击，肽键形成，肽链转移到 A 位的 tRNA 上。催化由 23S rRNA 完成。这一步不需要 ATP 或 GTP。 移位（translocation）：EF-G-GTP 结合，水解 GTP，核糖体沿 mRNA 移动一个密码子，A 位的肽酰-tRNA 移到 P 位，P 位的空载 tRNA 移到 E 位并释放。
能量账：每加一个氨基酸消耗 4 个高能键：2 ATP（氨酰-tRNA 合成，ATP→AMP+PPi）+ 1 GTP（进位）+ 1 GTP（移位）。
保真机制：① 密码子-反密码子配对的几何匹配；② EF-Tu 的动力学校对（错误配对的复合物解离快）；③ 核糖体的构象校对。
12.3.3 终止
终止密码子（UAA、UAG、UGA）进入 A 位，没有对应的 tRNA。 RF1 识别 UAA/UAG，RF2 识别 UAA/UGA，RF3（GTP 酶）辅助。 释放因子促使肽基转移酶中心把肽链转移到水上（水解），肽链释放。 核糖体解体（RRF、EF-G、IF3 参与），tRNA 释放，mRNA 释放。
12.4 真核生物的翻译
12.4.1 与原核的主要差异
12.4.2 起始（扫描模型）
eIF4F 复合物：由 eIF4E（帽结合蛋白）、eIF4G（支架蛋白）、eIF4A（解旋酶）组成，结合 mRNA 的 5' 帽子。 43S 预起始复合物：40S + eIF1、eIF1A、eIF3 + eIF2-GTP-Met-tRNA^Met（三元复合物）。 结合与扫描：43S 结合到 mRNA 的 5' 端，沿 mRNA 向 3' 方向扫描，寻找第一个 AUG（在 Kozak 序列 GCCRCCAUGG 的上下文中）。 60S 加入：找到起始密码子后，eIF2 水解 GTP，eIF5B 帮助 60S 加入，形成 80S 起始复合物。
Kozak 序列：AUG 上下游的保守序列，影响起始效率。AUG 在 -3 位是 A 或 G、+4 位是 G 时起始效率最高。
eIF2 的调控：eIF2α 的磷酸化（由 PERK、GCN2、PKR、HRI 激酶）抑制翻译起始，是整合应激反应（ISR） 的核心。病毒感染、氨基酸缺乏、血红素缺乏、内质网应激都通过这条通路抑制翻译。
IRES（内部核糖体进入位点）：某些病毒（如丙肝病毒 HCV、脊髓灰质炎病毒）的 mRNA 不需要帽子，通过 IRES 直接招募 40S。这是病毒"帽子非依赖翻译"的策略。
12.4.3 延伸与终止
延伸因子：eEF1A（对应 EF-Tu，携带氨酰-tRNA）、eEF1B（GDP/GTP 交换）、eEF2（对应 EF-G，移位）。
终止：eRF1 识别三个终止密码子，eRF3（GTP 酶）辅助，ABCE1 参与核糖体解体。
12.4.4 多核糖体与"闭环"模型
多核糖体（polysome）：一条 mRNA 上同时结合多个核糖体，同时翻译，提高效率。这是原核和真核共有的。
闭环模型：真核 mRNA 的 5' 帽（eIF4E）与 3' poly(A)（PABP）通过 eIF4G 连接，形成闭环。功能：① 保证 mRNA 的完整性（只有完整的 mRNA 才能高效翻译）；② 核糖体终止后可以就近重新起始（"重新起始"效率高）；③ 提高翻译效率。
12.5 翻译后加工
新生肽链通常没有活性，需要经过加工才能成为成熟蛋白质。
12.5.1 切除
切除 N 端的甲硫氨酸（甲硫氨酸氨肽酶）。 切除信号肽（信号肽酶）。 切除前导序列（如胰岛素原 → 胰岛素 + C 肽）。 多蛋白前体的切割（如病毒多蛋白、阿黑皮素原 POMC）。
12.5.2 修饰
12.5.3 折叠
分子伴侣：Hsp70、Hsp60（GroEL/GroES）、Hsp90、PDI、PPIase。 折叠的层次：二级结构 → 疏水塌缩 → 三级结构 → 亚基组装。 折叠病：朊病毒病、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病。
12.5.4 亚基组装与辅基结合
多亚基蛋白需要正确组装（如血红蛋白的 α₂β₂）；金属蛋白需要插入金属离子；含血红素的蛋白需要插入血红素。
12.6 蛋白质的靶向运输
12.6.1 信号肽假说（Blobel, 1975）
信号肽：新生肽链 N 端的 15—30 个氨基酸，富含疏水残基（核心是 6—12 个连续的疏水氨基酸），引导蛋白质进入内质网。
共翻译转运（分泌蛋白、膜蛋白、溶酶体蛋白）
信号肽从核糖体出口露出，被 SRP（信号识别颗粒） 识别并结合，翻译暂停。 SRP-核糖体复合物结合到内质网膜上的 SRP 受体。 SRP 释放，核糖体与转位子（translocon，Sec61 复合体） 结合，翻译恢复。 信号肽插入转位子，新生肽链穿膜进入内质网腔。 信号肽酶切除信号肽，肽链在内质网中折叠、修饰。 通过 COPII 囊泡运到高尔基体，再分选到目的地。
Blobel 因此获得 1999 年诺贝尔生理学或医学奖。
12.6.2 其他靶向信号
NLS 的特点：不是切除的，而是可逆的（有些蛋白在核和胞质之间穿梭）；NLS 可以被"遮蔽"（如 NF-κB 与 IκB 结合时 NLS 被掩盖，不能入核）。
12.7 翻译的抑制剂
选择性毒性的原理：抗生素（链霉素、四环素、氯霉素、红霉素）作用于原核核糖体，对人（80S）作用弱，所以可以抗菌。环己酰亚胺作用于真核，是实验室研究工具。
12.8 本章高频考点与易错点
判断题陷阱
"遗传密码是重叠的"——错，一般不重叠。 "每个氨基酸都有多个密码子"——错，Met 和 Trp 各只有一个。 "终止密码子编码氨基酸"——错，不编码（除特殊情况下 UGA 编码硒半胱氨酸）。 "原核起始氨基酸是甲硫氨酸"——错，是甲酰甲硫氨酸（fMet）。 "核糖体的肽基转移酶是蛋白质"——错，是 rRNA。 "翻译过程中每加一个氨基酸消耗 2 个高能键"——错，4 个（2 ATP + 2 GTP）。 "真核翻译起始依赖 SD 序列"——错，依赖帽子和扫描；SD 是原核的。 "转肽反应需要 GTP"——错，转肽本身不需要能量，能量用于进位和移位。 "氨酰-tRNA 合成酶没有校对功能"——错，有双筛校对。 "信号肽在 C 端"——错，在 N 端（多数）。 "线粒体蛋白通过共翻译转运进入线粒体"——错，是翻译后转运。 "氯霉素抑制真核核糖体"——错，抑制原核 50S。 "嘌呤霉素只抑制原核"——错，原核真核都抑制。 "遗传密码在所有生物中完全通用"——错，线粒体有例外。 "多核糖体只在原核中存在"——错，真核也有。
简答题高频
遗传密码的基本特性。 原核与真核翻译起始的差异。 翻译的延伸过程及能量消耗。 氨酰-tRNA 合成酶的作用及校对机制。 核糖体的结构与功能位点。 蛋白质的翻译后加工类型。 信号肽假说及共翻译转运。 抗生素的作用机制（以翻译抑制剂为例）。 分子伴侣在蛋白质折叠中的作用。 蛋白质靶向运输的信号类型。
论述题方向
从基因到功能蛋白质，说明遗传信息表达的全过程及其调控。 抗生素的作用靶点及耐药机制。 蛋白质折叠、转运与疾病。 翻译调控与应激反应（eIF2α 磷酸化）。 无细胞蛋白合成系统与合成生物学。
第 13 章 基因表达调控与基因工程
本章知识骨架
基因表达调控
├── 原核基因表达调控
│ ├── 操纵子模型（Jacob & Monod）
│ ├── lac 操纵子（负控诱导 + CAP 正控）
│ ├── trp 操纵子（负控阻遏 + 衰减）
│ ├── ara 操纵子（双向调控）
│ ├── 衰减子机制
│ └── σ 因子切换、全局调控（ppGpp、cAMP）
├── 真核基因表达调控
│ ├── 染色质水平（DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑）
│ ├── 转录水平（顺式元件、反式因子、增强子、绝缘子）
│ ├── 转录后（可变剪接、RNA 编辑、miRNA、mRNA 稳定性）
│ ├── 翻译水平（eIF2α、miRNA、uORF）
│ └── 翻译后（修饰、降解）
├── 表观遗传
├── 基因工程
│ ├── 工具酶（限制酶、连接酶、聚合酶、逆转录酶）
│ ├── 载体（质粒、噬菌体、cosmid、BAC、YAC、表达载体）
│ ├── 基本流程（切、接、转、选、表达）
│ ├── 筛选与鉴定（抗性、蓝白斑、PCR、测序、杂交）
│ └── 表达系统（大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞）
├── 基因编辑
│ ├── 同源重组
│ ├── 锌指核酸酶（ZFN）、TALEN
│ └── CRISPR-Cas9
└── 应用与前沿
├── 重组蛋白药物（胰岛素、干扰素、疫苗）
├── 基因治疗
├── 转基因动植物
├── 合成生物学
└── 基因检测与精准医学
13.1 原核基因表达调控
13.1.1 操纵子模型
操纵子（operon）：原核生物中，功能相关的一组基因串联在一起，共用一个启动子和一个调控区，协同转录，形成一条多顺反子 mRNA。这是原核基因调控的基本单位。
操纵子的组成
Jacob 和 Monod 于 1961 年提出操纵子模型，用 lac 系统研究，获得 1965 年诺贝尔生理学或医学奖。
两种调控方式
负调控（negative control）：阻遏蛋白结合操纵基因，阻止转录。分为诱导（induction）（有诱导物时解除阻遏）和阻遏（repression）（有辅阻遏物时加强阻遏）。 正调控（positive control）：激活蛋白结合启动子上游，促进转录。
13.1.2 lac 操纵子（负控诱导 + 正控）
结构
调节基因 lacI | 启动子 P | 操纵基因 O | lacZ | lacY | lacA
lacZ：β-半乳糖苷酶，水解乳糖为葡萄糖和半乳糖，也催化乳糖的异构化（生成异乳糖）和转糖基反应（产生有色产物，用于蓝白斑筛选）。 lacY：乳糖通透酶，把乳糖运进细胞。 lacA：硫代半乳糖苷转乙酰酶，功能不明确（可能解毒）。
负调控机制
无乳糖时：lacI 产生的阻遏蛋白（四聚体）结合到操纵基因 O 上，阻止 RNA 聚合酶前进，转录关闭。 有乳糖时：乳糖经 β-半乳糖苷酶转化为异乳糖（allolactose），异乳糖结合阻遏蛋白，使其构象改变、从 DNA 上脱落，转录开启。 乳糖是"诱导物"，但真正的诱导物是异乳糖。实验室常用的诱导物是 IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），它不是 β-半乳糖苷酶的底物，所以诱导效果稳定，不会被代谢掉。
正调控机制（CAP-cAMP）
葡萄糖缺乏时，cAMP 升高；cAMP 与 CAP（catabolite activator protein，降解物基因激活蛋白） 结合，CAP-cAMP 复合物结合到启动子上游的 CAP 位点，促进 RNA 聚合酶结合，转录大幅提高。 葡萄糖充足时，cAMP 降低，CAP 不能结合，转录水平低。
双重调控的逻辑（"葡萄糖效应"）
意义：大肠杆菌优先利用葡萄糖；只有在没有葡萄糖、又有乳糖时，才大量表达 lac 操纵子。这是"经济原则"的体现——不浪费能量合成不需要的酶。
lacI 的突变：lacI⁻（不能产生阻遏蛋白，组成型表达）、lacI^s（超阻遏，即使有诱导物也不表达）。这些突变体是研究操纵子的重要工具。
13.1.3 trp 操纵子（负控阻遏 + 衰减）
结构：trpE、trpD、trpC、trpB、trpA 五个结构基因，编码合成色氨酸的酶。
负控阻遏
无色氨酸时，阻遏蛋白（trpR 编码）无活性，不能结合操纵基因，转录开启。 色氨酸充足时，色氨酸作为辅阻遏物与阻遏蛋白结合，使其活化，结合操纵基因，转录关闭。
衰减（attenuation）
这是 trp 操纵子特有的第二重调控，比阻遏更精细。
机制：
trp 操纵子的前导区（leader region）编码一段前导肽，含两个连续的 Trp 密码子。 前导区 mRNA 可以形成两种不同的二级结构： 终止发夹（3-4 配对）：后面跟着 polyU，转录提前终止。 抗终止发夹（2-3 配对）：转录继续。 哪种结构形成，取决于核糖体翻译前导肽的速度，而这取决于色氨酸的浓度： 色氨酸充足：核糖体快速通过 Trp 密码子，进入 2 区，2 区被核糖体占据，不能与 3 区配对，3 区与 4 区配对形成终止发夹，转录终止。 色氨酸缺乏：核糖体在 Trp 密码子处停滞，2 区空闲，2 区与 3 区配对，4 区不能形成终止发夹，转录继续。
意义：衰减机制使 trp 操纵子可以对色氨酸浓度做出连续、精细的响应（不只是"开/关"），调节范围可达 10 倍以上。这是"转录与翻译偶联"在原核中的巧妙应用。
13.1.4 ara 操纵子（双向调控）
阿拉伯糖操纵子（araBAD）的调控蛋白 AraC 有两种构象：
无阿拉伯糖时，AraC 结合 O₂ 和 I₁ 位点，形成 DNA 环，阻遏转录。 有阿拉伯糖时，AraC 构象改变，结合 I₁ 和 I₂ 位点，激活转录。
AraC 既是阻遏蛋白又是激活蛋白，取决于配体和 DNA 结合位点。这是"一个蛋白两种功能"的经典例子。
13.1.5 全局调控
cAMP-CAP：调控大量分解代谢基因（葡萄糖效应）。 ppGpp（魔斑）：氨基酸饥饿时产生，抑制 rRNA 合成，启动氨基酸合成基因，是"严紧反应"的信号。 σ 因子切换：热休克、氮饥饿等。 群体感应（quorum sensing）：细菌通过自诱导物感知群体密度，协调基因表达（如发光、生物膜形成、毒力因子）。
13.2 真核基因表达调控
真核的调控比原核复杂得多，因为：① 基因组大、基因多；② 有核膜，转录和翻译分离；③ 染色质结构；④ 多细胞生物的细胞分化需要精确的时空调控。
13.2.1 染色质水平
DNA 甲基化
主要发生在 CpG 岛的胞嘧啶（5-甲基胞嘧啶，5-mC）。 由 DNA 甲基转移酶（DNMT1 维持甲基化，DNMT3A/3B 从头甲基化）催化。 启动子区的高甲基化通常抑制转录（甲基化结合蛋白 MeCP2 招募 HDAC，形成异染色质）。 基因组印记（如 Igf2/H19）、X 染色体失活、转座子沉默都依赖 DNA 甲基化。 去甲基化：TET 酶氧化 5-mC 为 5-hmC，再经碱基切除修复去除。
组蛋白修饰
"组蛋白密码"假说：不同修饰的组合决定染色质的状态和基因表达。这个假说还在发展中，但"修饰组合决定功能"的思路被广泛接受。
染色质重塑
SWI/SNF 复合体：ATP 依赖，滑动或驱逐核小体，开放染色质。 ISWI、CHD、INO80 家族：不同的重塑活性。 组蛋白变体（H2A.Z、H3.3、CENP-A）的替换也改变染色质性质。
13.2.2 转录水平
顺式作用元件
启动子（TATA box、Inr、CAAT box、GC box）。 增强子（远距离，位置方向无关）。 沉默子。 绝缘子（阻断增强子作用，划分染色质结构域）。 座位控制区（LCR，如 β-珠蛋白基因簇的 LCR，控制整个基因簇的表达）。
反式作用因子（转录因子）
结构域：
DNA 结合域：锌指（C₂H₂、C₄）、同源域（homeodomain）、亮氨酸拉链（bZIP）、螺旋-转角-螺旋（HTH）、螺旋-环-螺旋（bHLH）、HMG 盒。 转录激活域：酸性域、富含 Gln/Pro 的域。 二聚化域：亮氨酸拉链、bHLH。 配体结合域：核受体（雌激素受体、糖皮质激素受体）。
调控方式：
表达量（合成与降解）。 定位（NLS、磷酸化调控入核）。 活性（磷酸化、配体结合、与抑制蛋白结合）。 辅因子（共激活因子、共抑制因子）。
典型例子：
NF-κB：与 IκB 结合时在胞质失活；信号刺激下 IκB 被降解，NF-κB 入核，激活免疫基因。 p53："基因组卫士"，DNA 损伤时稳定化，激活 p21（细胞周期停滞）、Bax（凋亡）等靶基因。 核受体：糖皮质激素受体与热休克蛋白结合时在胞质；激素结合后入核，激活或抑制靶基因。
13.2.3 转录后水平
可变剪接（第 11 章讲过）。 RNA 编辑。 miRNA/siRNA：抑制翻译或降解 mRNA。 mRNA 稳定性：AU 富集元件（ARE）促进降解；miRNA 结合促进脱腺苷酸化。 mRNA 定位：某些 mRNA 被运到特定区域翻译（如神经元树突）。 无义介导的降解（NMD）：含提前终止密码子的 mRNA 被降解，是质量控制机制。
13.2.4 翻译水平
eIF2α 磷酸化：整合应激反应，全局抑制翻译，同时选择性翻译 ATF4 等应激蛋白。 uORF（上游开放阅读框）：调控下游主 ORF 的翻译效率。 miRNA：抑制翻译起始或延伸。 mRNA 二级结构：5'-UTR 的发夹结构抑制扫描。 多聚腺苷酸尾巴长度：影响翻译效率（早期胚胎发育中重要）。
13.2.5 翻译后水平
修饰（磷酸化、泛素化）。 降解（泛素-蛋白酶体、自噬）。 定位（信号肽、NLS）。 活性调节（别构、切割）。
13.3 表观遗传
定义：DNA 序列不变、但基因表达可遗传的改变。包括 DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码 RNA 调控。
经典现象
X 染色体失活：雌性哺乳动物的一条 X 染色体被 Xist lncRNA 覆盖，招募 PRC2，H3K27me3 修饰，形成巴氏小体。 基因组印记：某些基因只表达父源或母源的一个拷贝（如 Igf2 只表达父源，H19 只表达母源），由差异甲基化区（DMR）控制。 位置效应：基因插入到异染色质区域时被沉默。
与环境的关系：营养、应激、毒素可以改变表观遗传标记，甚至传递给后代（跨代表观遗传）。这是"环境与基因交互作用"的分子基础。
与疾病：癌症中常见全基因组低甲基化 + 特定抑癌基因启动子高甲基化；表观遗传药物（DNMT 抑制剂阿扎胞苷、HDAC 抑制剂伏立诺他）已用于临床。
13.4 基因工程
13.4.1 工具酶
13.4.2 载体
载体（vector）：能把外源 DNA 带入宿主细胞并使其复制、表达的 DNA 分子。
基本要求：① 能自主复制（有复制起点）；② 有筛选标记（抗生素抗性）；③ 有多个限制酶切位点（多克隆位点 MCS）；④ 分子小、拷贝数高、易操作；⑤ 有启动子（表达载体）。
pUC 系列的特点：含氨苄青霉素抗性基因、lacZ' 基因（用于蓝白斑筛选）、多克隆位点位于 lacZ' 内。
13.4.3 基本流程（"切、接、转、选、表达"）
获取目的基因： PCR 扩增（从基因组 DNA 或 cDNA）。 化学合成（短基因）。 从文库中筛选。 限制酶切（从已有质粒中切出）。 切割：用限制酶切目的基因和载体，产生兼容的黏性末端或平末端。 连接：T4 DNA 连接酶连接，形成重组 DNA。 转化：把重组 DNA 导入宿主细胞（大肠杆菌用 CaCl₂ 法或电穿孔；真核用脂质体、电穿孔、显微注射、病毒载体）。 筛选： 抗性筛选：只有含载体的细胞能在抗生素培养基上生长。 蓝白斑筛选：含插入片段的重组质粒使 lacZ' 失活，菌落为白色；空载体为蓝色（X-gal 被 β-半乳糖苷酶水解产生蓝色产物）。 菌落 PCR：用引物扩增插入片段。 限制酶切图谱：切出预期大小的片段。 核酸杂交：用探针筛选。 测序：最终确认。 表达与纯化：诱导表达（IPTG），收集菌体，破碎，纯化（His-tag 用 Ni 柱）。
13.4.4 表达系统
13.4.5 基因编辑
第一代：同源重组
用打靶载体与基因组同源序列重组，替换目标基因。效率极低（10⁻⁶—10⁻⁷），主要用于小鼠胚胎干细胞。
第二代：ZFN 和 TALEN
锌指核酸酶（ZFN）：锌指蛋白识别 DNA + FokI 核酸酶切割。设计困难（锌指的特异性有限）。 TALEN：TALE 蛋白的重复模块识别单个碱基，设计简单，特异性高。
第三代：CRISPR-Cas9
组成：Cas9 核酸酶 + sgRNA（单链引导 RNA，含 20 nt 与靶序列互补的间隔序列）。 机制：sgRNA 引导 Cas9 到靶位点，Cas9 识别 PAM 序列（NGG），切割双链（产生平末端）。细胞通过 NHEJ 修复（产生插入/缺失，敲除基因）或 HR 修复（精确编辑，需提供模板）。 来源：细菌的适应性免疫系统（CRISPR 阵列记录噬菌体序列，转录为 crRNA，引导 Cas 切割）。 2020 年诺贝尔化学奖（Charpentier、Doudna）。 衍生工具：Cas9 切口酶（nCas9）、dead Cas9（dCas9，无切割活性，用于基因抑制 CRISPRi、激活 CRISPRa、碱基编辑、表观编辑）、碱基编辑器（CBE、ABE）、先导编辑（prime editing）。
应用：基因功能研究、疾病模型、作物改良、基因治疗（镰状细胞贫血的 exa-cel 已获批）、诊断（SHERLOCK、DETECTR）。
伦理问题：生殖系编辑（贺建奎事件）引发全球争议，目前多数国家禁止。
13.5 本章高频考点与易错点
判断题陷阱
"操纵子只在真核生物中存在"——错，原核的调控单位。 "lac 操纵子是正调控"——不全面，是负控诱导 + CAP 正控。 "乳糖是 lac 操纵子的直接诱导物"——错，异乳糖才是；乳糖需经 β-半乳糖苷酶转化。 "IPTG 是 β-半乳糖苷酶的底物"——错，是诱导物但不是底物（所以不被代谢）。 "葡萄糖存在时 lac 操纵子高表达"——错，低表达（葡萄糖效应）。 "trp 操纵子只有阻遏调控"——错，还有衰减调控。 "衰减机制依赖转录与翻译的偶联"——正确（原核特有）。 "增强子的作用与方向和位置无关"——正确。 "DNA 甲基化通常促进转录"——错，通常抑制。 "H3K4me3 是抑制性修饰"——错，是激活性的；H3K27me3 才是抑制性。 "表观遗传改变 DNA 序列"——错，不改变序列。 "质粒载体必须含抗生素抗性基因"——正确（用于筛选）。 "蓝白斑筛选中蓝色菌落含重组质粒"——错，白色才是重组。 "CRISPR-Cas9 需要 PAM 序列"——正确（SpCas9 识别 NGG）。 "CRISPR 是人工发明的"——错，来源于细菌的免疫系统。 "Taq 酶有 3'→5' 外切活性"——错，没有校对活性，所以错误率高。 "cDNA 文库包含内含子"——错，cDNA 来自成熟 mRNA，不含内含子。 "基因组文库只包含表达的基因"——错，包含全部 DNA。
简答题高频
操纵子的概念及 lac 操纵子的调控机制。 葡萄糖效应及其分子机制。 trp 操纵子的衰减调控。 原核与真核基因表达调控的差异。 真核基因表达的多层次调控。 表观遗传的概念及机制。 基因工程的基本流程。 载体的基本要求及类型。 蓝白斑筛选的原理。 CRISPR-Cas9 的原理及应用。 原核与真核表达系统的比较。 基因组文库与 cDNA 文库的区别。
论述题方向
从操纵子到增强子，说明基因表达调控的进化。 基因工程在医药领域的应用（以重组胰岛素、抗体药物为例）。 CRISPR 基因编辑的原理、应用与伦理。 表观遗传与疾病、环境的关系。 合成生物学的发展与挑战。
13.6 专题：分子生物学常用技术汇总
870 的论述题有一条固定的出题路子：给一个研究目标，问你用什么技术、原理是什么、怎么判断结果。2024 年那道"从基因序列、代谢和酶的结构等方面分析酶失活的原因"就是这种路子。
这一节把常用技术按"检测什么"分类列出来。答题时先判断"要检测的对象是 DNA、RNA、蛋白质还是相互作用"，再从对应的类别里选。
13.6.1 按检测对象分类
检测 DNA
检测 RNA
检测蛋白质
检测相互作用
检测基因功能
13.6.2 三个"印迹"的记忆法
这是最基础也最容易混的一组：
Southern 测 DNA（Southern 是人的名字，先有他，后面的都是玩谐音）。 Northern 测 RNA（"n" 可以联想 RNA 的 n）。 Western 测 蛋白质（抗体检测，和前面两个的原理不同）。
再补两个不常考但可能出现的：
Eastern 印迹：测翻译后修饰（如糖基化），用特异识别修饰的探针，不常用。 Southwestern 印迹：检测 DNA-蛋白相互作用，把 DNA 探针加到转有蛋白的膜上。
13.6.3 如何回答"设计实验"类论述题
标准五步：
明确要检测的分子（DNA / RNA / 蛋白 / 相互作用 / 功能）。 选择技术并说明原理（不要只写技术名，要写"用什么原理检测什么"）。 设置对照（阴性对照、阳性对照、内参）。这一步很多人漏掉，但它是评分点。 说明结果如何判读（出现什么条带/信号说明什么）。 说明局限（假阳性、灵敏度、是否需要验证）。
举例：如何证明某转录因子调控靶基因 X？
表达相关性：用 RT-qPCR 检测不同条件下 TF 和 X 的 mRNA 水平，看是否正相关。 结合证据：ChIP-qPCR 证明 TF 结合到 X 的启动子；EMSA 体外验证结合；报告基因实验证明 X 的启动子被 TF 激活。 功能证据：敲低/敲除 TF，看 X 的表达是否下降；过表达 TF，看 X 是否升高。 对照：非相关抗体做 ChIP 对照；突变启动子的报告基因做对照；内参基因做 qPCR 对照。 结论：三条证据链齐备，才能说"调控"。
这五步的框架可以套用到几乎所有"机制研究"的论述题上。
13.6.4 测序技术三代对比
应用选择：验证单个突变用 Sanger；全基因组、转录组用 Illumina；组装复杂基因组、检测结构变异、直接测甲基化用三代。
13.6.5 前沿热点（可能出现在论述题）
870 的论述题有"相关领域最新进展"的传统，以下五个方向最可能被问到，每个准备三句话即可。
（1）CRISPR 基因编辑
三句话：来源于细菌免疫系统；sgRNA 引导 Cas9 切割靶 DNA，依赖 PAM；已用于基因治疗（镰状细胞贫血）、作物改良、核酸检测，衍生出碱基编辑和先导编辑。伦理争议集中在生殖系编辑。
（2）mRNA 疫苗
三句话：把编码抗原的 mRNA 用脂质纳米颗粒（LNP）递送到细胞，翻译出抗原蛋白，激活免疫；关键技术是假尿苷修饰（降低免疫原性、提高稳定性）和 LNP 递送；新冠疫苗是其首个大规模应用。
（3）AlphaFold 与蛋白质结构预测
三句话：用深度学习从序列预测三维结构；2020 年 CASP14 达到实验精度；改变了结构生物学的研究方式，但不能替代实验验证动态构象和配体结合。
（4）合成生物学
三句话：把工程学思路用于生物系统，标准化元件（BioBrick）、底盘细胞、代谢工程；应用包括青蒿素前体、人造淀粉、生物基材料；挑战是代谢负担、遗传稳定性、伦理与生物安全。
（5）单细胞技术
三句话：单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）揭示细胞异质性；空间转录组保留位置信息；应用于肿瘤微环境、发育生物学、免疫学。
（6）相分离与无膜细胞器
三句话：蛋白质和 RNA 通过液-液相分离形成无膜细胞器（如核仁、应激颗粒）；参与基因调控、信号转导；异常相分离与神经退行性疾病相关。
13.7 随章练习（第五册综合）
一、名词解释
半保留复制：子代 DNA 一条链来自亲代、一条链新合成的复制方式。 冈崎片段：滞后链上分段合成的短 DNA 片段。 半不连续复制：前导链连续、滞后链不连续复制的机制。 端粒酶：含 RNA 模板的逆转录酶，延长端粒。 逆转录：以 RNA 为模板合成 DNA 的过程。 操纵子：原核中功能相关基因串联、共用启动子和调控区的转录单位。 衰减子：trp 操纵子前导区通过翻译速度调控转录终止的机制。 增强子：远距离、位置方向无关地提高转录的顺式元件。 剪接体：由 snRNP 和蛋白组成、催化 mRNA 剪接的复合物。 可变剪接：同一 pre-mRNA 产生多种成熟 mRNA 的剪接方式。 遗传密码的简并性：多个密码子编码同一氨基酸的现象。 摆动假说：密码子第三位配对具有一定灵活性的假说。 SD 序列：原核 mRNA 的核糖体结合位点。 信号肽：引导蛋白质进入内质网的 N 端疏水序列。 分子伴侣：帮助蛋白质折叠、组装、转运的蛋白质。 表观遗传：DNA 序列不变而基因表达可遗传的改变。 限制性核酸内切酶：识别特定序列切割 DNA 的酶。 载体：能携带外源 DNA 进入宿主并复制表达的 DNA 分子。 cDNA 文库：某一组织表达的全部 mRNA 的 cDNA 克隆集合。 CRISPR-Cas9：由 sgRNA 引导、识别 PAM 序列切割 DNA 的基因编辑系统。
二、简答题
1. 半不连续复制的机制及意义。
DNA 聚合酶只能沿 5'→3' 方向合成，而两条模板链方向相反。在复制叉处，前导链的模板是 3'→5' 方向，新链可连续合成；滞后链的模板是 5'→3' 方向，新链必须分段合成，每段都从 5'→3' 方向起始，形成冈崎片段。每个片段需要一个 RNA 引物，由引物酶合成；pol III 延伸；pol I 切除引物并填补；连接酶封口。
意义：解决了"两条反向平行链如何同时复制"的矛盾，保证了复制的连续性和效率；同时为 DNA 修复和重组提供了中间体。
2. 比较复制与转录。
见第 10 章表格。核心差异：复制用两条链为模板、产物是 DNA、需引物、有校对、半不连续；转录用一条链、产物是 RNA、不需引物、无校对、连续。复制每细胞周期一次，转录可多次且受调控。
3. 说明 lac 操纵子的双重调控。
负控诱导：无乳糖时，lacI 编码的阻遏蛋白结合操纵基因 O，阻止转录；有乳糖时，乳糖经 β-半乳糖苷酶转化为异乳糖，异乳糖结合阻遏蛋白使其脱落，转录开启。
正控：葡萄糖缺乏时 cAMP 升高，cAMP-CAP 复合物结合启动子上游的 CAP 位点，促进 RNA 聚合酶结合，转录大幅提高；葡萄糖充足时 cAMP 低，CAP 不能结合，转录水平低。
双重调控的结果：只有在无葡萄糖、有乳糖时，lac 操纵子才高表达，体现了"优先利用葡萄糖"的经济原则。
4. 原核与真核基因表达调控有何差异？
① 调控单位：原核以操纵子为单位，真核以单基因为单位；② 转录翻译关系：原核偶联，真核分离；③ 染色质：原核无核小体，真核有复杂的染色质结构（甲基化、组蛋白修饰、重塑）；④ 调控层次：真核多了染色质水平、转录后加工、RNA 稳定性、翻译调控等多个层次；⑤ 顺式元件：原核以启动子、操纵基因为主，真核有增强子、沉默子、绝缘子、LCR；⑥ 反式因子：原核以阻遏蛋白、激活蛋白为主，真核有大量转录因子、辅因子、中介体；⑦ 响应速度：原核快（秒到分钟），真核慢（小时到天），但更精细。
5. 简述基因工程的基本流程。
① 获取目的基因（PCR、化学合成、文库筛选）；② 用限制酶切割目的基因和载体，产生兼容末端；③ 用 DNA 连接酶连接，形成重组 DNA；④ 转化宿主细胞（CaCl₂ 法、电穿孔、脂质体）；⑤ 筛选（抗性、蓝白斑、PCR、酶切、测序）；⑥ 诱导表达与纯化。
6. CRISPR-Cas9 的原理及应用。
原理：sgRNA 含 20 nt 与靶序列互补的间隔序列，引导 Cas9 核酸酶到靶位点；Cas9 识别靶序列旁的 PAM（SpCas9 为 NGG），切割双链产生平末端；细胞通过 NHEJ 修复（产生插入/缺失，敲除基因）或同源重组修复（精确编辑）。CRISPR 来源于细菌的适应性免疫系统。
应用：基因功能研究、疾病模型构建、作物改良、基因治疗（镰状细胞贫血）、核酸检测（SHERLOCK）。衍生工具：dCas9（基因抑制/激活）、碱基编辑器、先导编辑。
7. 说明原核与真核翻译起始的差异。
原核：30S 通过 16S rRNA 与 mRNA 的 SD 序列互补配对定位起始密码子；起始 tRNA 是 fMet-tRNA^fMet；起始因子 IF1、IF2、IF3；mRNA 是多顺反子，每个顺反子有独立的 SD 序列；转录翻译偶联。
真核：40S 通过 eIF4F 结合 5' 帽子，沿 mRNA 扫描寻找第一个 AUG（Kozak 序列上下文）；起始 tRNA 是 Met-tRNA^Met；起始因子 12 种以上；mRNA 是单顺反子；转录翻译分离；有 IRES 介导的帽子非依赖起始。
本册收尾：中心法则的完整链条
把这一册的四章连起来，就是一条完整的信息流：
DNA（复制，半保留）→ RNA（转录，模板链）→ 蛋白质（翻译，密码子-反密码子）→ 功能（折叠、修饰、定位）
每一个环节都有对应的调控：
复制层面：起始频率、复制 licensing。 转录层面：操纵子、增强子、染色质。 转录后：剪接、编辑、稳定性。 翻译层面：eIF2α、miRNA、uORF。 翻译后：修饰、降解、定位。
870 的论述题如果问"基因表达调控"，标准答法是按这五个层面分层，每层举一到两个例子。这个框架比背零散知识点有效得多。
下一册是背诵手册、真题和模拟卷。它的作用是把前五册的知识压缩成可以在考场上提取的形式。
第五册完。下一册：《背诵手册、真题汇编与模拟卷》。
